Menolasina, Rodríguez
DETECCIÓN
ELECTROQUÍMICA
DE VIRUS EN MUESTRAS
DE
ALLIUM SATIVUM L. CULTIVADAS EN EL PÁRAMO ANDINO
DE
VENEZUELA
Sabino Menolasina*, Dianaly Rodríguez
*Laboratorio de Investigaciones Electroquímicas. Cátedra de Fisicoquímica.
Facultad de Farmacia y Bioanálisis. Universidad de Los Andes.
Mérida-Venezuela501.
E-mail: *sabino@ula.ve
R
esumen
A
bstract
Introducción
relativamente pequeñas. Las zonas de producción de ajo se
concentran en los estados Mérida, Lara, Táchira y Trujillo,
siendo el estado Mérida el de mayor producción. El Allium
sativum L., ocupa el tercer lugar de importancia dentro del
grupo de las hortalizas comercialmente cultivadas en el
estado Mérida/Venezuela después de la papa y zanahoria.
Esto se debe a que en zonas de cultivo por encima de los
1.000 metros, donde las condiciones tropicales todavía
predominan, las condiciones agroecológicas son ideales
Elajo(AlliumsativumL.)esconsideradoen
Venezuela como una hortaliza importante
por las excelentes cualidades para la
salud y gastronomía (1). Desde el punto
de vista económico le ofrece al productor
un considerable margen de ganancia
a corto plazo en superficies cultivadas
17
An electrochemical immunosensor for detecting the presence or non-presence of certain Allexivirus
on garlic samples Allium sativum L. from the Rivas Davila municipality (Bailadores) Merida state,
was constructed and characterized using the electrochemical technique, cyclic voltammetry (CV). The
immunosensor has as biological recognition element, mononuclear Allexivirus antibodies específic
to GarV-A adsorbed onto a glassy carbon electrode previously
modified
with thiourea (TIO) and gold
nanoparticle monolayers (AuNPs) synthesized in the laboratory and characterized by Transmission
Electron Microscopy (TEM), which were interspersed by electrostatic attraction with methylene
blue monolayer (AM). The immunosensor showed high specificity and sensitivity to the presence of
Allexivirus in the analyzed samples.
Keywords: electrochemical immunosensor, allium sativum l, allexivirus, cyclic voltammetry
Un inmunosensor electroquímico para detectar la presencia o no de ciertos Allexivirus en muestras
de ajo Allium sativum L. provenientes del Municipio Rivas Dávila (Bailadores) del estado Mérida fue
construido y caracterizado empleando la técnica electroquímica, Voltamperometría Cíclica (VC). El
inmunosensor posee como elemento de reconocimiento biológico anticuerpos mononucleares anti-
Allexivirus específicos contra GarV-A, absorbidos sobre un electrodo de carbón vítreo previamente
modificado con tiourea (TIO) y monocapas de nanopartículas de oro (AuNPs) sintetizadas en el
laboratorio y caracterizadas por Microscopia Electrónica de Transmisión (MET), las cuales fueron
intercaladas por atracción electrostática con monocapas de azul de metileno (AM). El inmunosensor
mostró una alta
especificidad
y sensibilidad y permitió detectar la presencia de Allexivirus específicos
contra GarV-A en las muestras analizadas.
Palabras claves: immuno sensor electroquímico, Allium Sativum L., Allexivirus, voltametría cíclica
para expresar al máximo el potencial de rendimiento y
calidad de bulbos de ajo al momento de la cosecha. Sin
embargo, a pesar de las condiciones climáticas y de la
importancia económica y social que posee esta especie,
su producción en el estado Mérida ha disminuido en
los últimos años como consecuencia de varios factores,
entre los que destacan la carencia de semillas certificadas
para la siembra que aseguren el desarrollo y crecimiento
de plantas sanas (2). El ajo, aunque es una planta anual,
presenta la limitante de que sólo se reproduce de forma
asexual; esto lleva a que, en ciclos sucesivos de cultivo,
se produzca una acumulación del inóculo de muchos
patógenos como, hongos, bacterias y principalmente
virus; ocasionando la reducción de los rendimientos y la
calidad, con la consecuencia de pérdidas económicas. Los
productores venezolanos de ajo hacen uso de los dientes o
bulbos de procedencia desconocida como única forma de
propagación comercial del cultivo (2). Por la importancia
económica y social que el ajo representa para nuestra
región andina y el país, es necesario prestar atención a los
factores que ocasionan pérdidas a la producción, siendo
uno de ellos las enfermedades, y entre éstas, las causadas
por los virus. Actualmente la mayoría del ajo que se
produce en el estado Mérida está contaminado por virus.
La transmisión de virus en ajo se atribuye principalmente
a la reproducción vegetativa de la especie, sin embargo,
según lo descrito por Román y Núñez (3), las principales
enfermedades virales en ajo encontradas en el estado
Mérida son causadas por especies pertenecientes a dos
de sus familias formalmente reconocidas: Potyviridae y
Flexiviridae. Entre los miembros de la familia Potyviridae
se encuentran los virus enanismo amarillo de la cebolla
(Potyvirus Onion yellow dwarf virus: OYDV), reportado
como causante de achaparramientos y reducción de
tamaño del bulbo, y el virus rayado amarillo del puerro
(Leek yellow stripe virus: LYSV) causante de mosaico en
hojas.
La familia Flexiviridae comprende dos géneros: Carlavirus
y Allexivirus. El primero está representado por el virus
latente común de ajo (GCLV), que no produce síntomas
aparentes; sin embargo, en combinación con otras especies
causa serias pérdidas de cosechas. El segundo, el género
Allexivirus, se cree que son transmitidos por los ácaros
y tienen una organización del genoma similar a la del
Carlavirus. Este género incluye el virus X de chalote
(ShVX) y las líneas de virus de ajo ((Garlic virus A
(GarV-A), Garlic virus C (GarV-C), Garlic virus E (GarVE),
Garlic virus X (GarV-X) y las secuencias parciales de otros
tres (Garlic mite-borne filamentous virus (GarMbFV),
Garlic virus B (GarV-B) and Garlic virus D (GarV-D))
(4-6), causantes de mosaicos leves en
hojas. Los autores concluyeron que todo
el ajo cultivado porta una o más de estas
especies, formando complejos que de no
causar síntomas graves pueden ejercer
efectos nocivos sobre el comportamiento
fenotípico de este cultivo, como bajos
rendimientos, calibres reducidos del
bulbo y bajo contenido de materia seca.
La sanidad del producto, muy vinculada
con la calidad, es de vital importancia
para su comercialización, sobre todo
para su exportación a otros países. Para
el saneamiento del cultivo de ajo en
nuestra región andina, además de contar
con semillas certificadas, es necesario
identificar el tipo de virus que lo afecta
en las distintas zonas donde se cultiva,
eso solo se consigue a través de análisis
inmunológicos, los cuales consisten en
una reacción bioquímica que implica
el reconocimiento del virus o antígeno
(Ag) por un anticuerpo (Ac), al formarse
el complejo antígeno-anticuerpo. Los
anticuerpos proporcionan una alta
especificidad hacia un determinado
antígeno o análito de interés. Las técnicas
inmunológicas son poco accesibles, de
costo muy elevado, sus metodologías son
complejas y requiere de largos periodos
de tiempo para obtener
debido al tratamiento
previo que se le debe
los resultados
especializado
aplicar a las
muestras a ser analizadas. Todo esto hace
que no puedan ser utilizadas como rutina
para el control de calidad de una variedad
de plantas alimenticias en nuestro país.
Los inmunosensores electroquímicos
son sensores que se caracterizan por
presentar un anticuerpo como elemento
biológico de reconocimiento, el cual es el
responsable de la
especificidad
del sensor
y junto con un transductor electroquímico
transforman la reacción bioquímica en
una señal medible electroquímicamente.
Debido a la alta especificidad de un
inmunosensor y a la sensibilidad que
ofrecen las técnicas electroquímicas,
la detección de virus presentes en
verduras y hortalizas a través del uso de
18
ISSN 1390-5740 Número 15 Vol. 1 (2016)
ISSN 2477-9105
Menolasina, Rodríguez
inmunosensores electroquímicos, podría
ser una alternativa de bajo costo para el
control sanitario de estos rubros.
Actualmente se encuentra en la literatura
numerosos ejemplos de inmunosensores
electroquímicos basados en el empleo de
nanopartículas de oro como soporte del
anticuerpo y el antígeno, ya que éstas
proporcionan un ambiente similar a su
entorno natural. Además las partículas
nal de purificación.El agua utilizada fue de calidad Milli
Q 18 MΩ (Millipore, Milford, MA, USA). Todos los re-
activos fueron utilizados sin ningún tratamiento adicional
de purificación. Las soluciones fueron preparadas en agua
desionizada de 18 MΩ.cm y ajustadas a pH 6,5.
Tratamiento de la superficie electródica de carbón ví-
treo (SECV)
Las SECV fue pulida con diferentes grados de alúmina
(0,3 y 0,05 μm) provenientes de la Buehler usando agua
desionizada como lubricante. Posterior a dicha limpieza
mecánica, dicha superficie fue sometida a una limpieza
electroquímica por VC en una solución 0,1M HClO4 apli-
cando un determinado número de barridos cíclicos entre
-0,2 V y 1,7 V. Una vez que la SECV fue tratada siguiendo
los pasos descritos anteriormente se procedió a caracteri-
zarla electroquímicamente y a realizar las distintas modifi-
caciones sobre su superficie con la finalidad de desarrollar
el inmunosensor electroquímico.
metálicas
actúan
como
medio de
conducción electrónico, facilitando la
transferencia electrónica, permitiendo
alcanzar elevados niveles de estabilidad
y sensibilidad (7).
En el presente trabajo se desarrollo
un
inmunosensor
electroquímico
utilizando AuNPs sintetizadas en el
laboratorio, como soporte del elemento
de
reconocimiento
biológico
(anti-
Allexivirus específicos contra GarV-A)
para detectar la presencia de Allexi virus
en muestras de ajo empleando VC.
Modificación electroquímica y química de la SECV
La electrodeposición de tiourea sobre la superficie de
SECV se hizo siguiendo el procedimiento descrito por
Chai et.al. (8). Bajo este procedimiento la TIO es adsor-
bida sobre la SECV. Posteriormente se procede a colocar
sobre la SECV modificada con TIO, 15 µL de una mezcla
coloidal de AuNPs, a la cual se le aplica aire frio hasta que
el solvente de la mezcla se evapore. Posteriormente esta
SECV modificada fue activada por VC en solución buffer
fosfato pH 6,7 antes de ser nuevamente modificada alter-
nando capas de AM y AuNPs.
Materiales y Métodos
Reactivos
Los anticuerpos mononucleares an-
ti-Allexivirus específicos contra GarV-A,
fueron suministrados por el Instituto Na-
cional de Investigaciones Agropecuarias
del Estado Mérida, en sueros concentra-
dos provenientes de conejos. Las mues-
tras de ajo contaminadas con Allexivirus
provenientes de la población de Baila-
dores, Municipio Rivas Dávila, Estado
Mérida se emplearon como antígenos en
los estudios electroquímicos que se reali-
zaron con el imunosensor. El ácido tetra-
cloroaurico y el citrato de sodio
(Na C H O ) utilizados en la síntesis
Tratamiento de la muestra
Los antígenos presentes en las muestras analizadas fueron
extraídos por trituración en mortero, de las hojas que recu-
bren al bulbo del Allium sativum. La muestra triturada fue
re-suspendida en solución reguladora de fosfato 0,1 M pH
6,5 y posteriormente filtrada. La solución resultante fue
protegida de la luz y guardada a 4
o
C.
3 6 5 7
de las AuNPs fueron suministrados por
MercK. El azul de metileno (C H N-
Aparatos
16
18
C S) y tiourea (CH N S) utilizados fue-
3 l
4 2
ron de grado analítico y suministrados
por Merck Los reactivos utilizados en la
preparación de las soluciones electrolíti-
cas fueron de grado analítico de la RDH y
utilizados sin ningún tratamiento adicio-
Los experimentos por VC se realizaron utilizando una cel-
da de vidrio de un compartimiento y tres electrodos. Un
electrodo de Ag/AgCl (sat) fue utilizado como electrodo de
referencia y un alambre de platino como electrodo secun-
dario. Como electrodo de trabajo se utilizó un electrodo de
19
carbón vítreo (CV) modificado electroquímica y química-
mente. Los experimentos por VC se realizaron utilizando
un potenciostato galvanostato Autolab PGSTAT12. Todo
el material de vidrio fue lavado inicialmente con detergen-
te y abundante agua desionizada.
La Figura 2A, muestra el espectro obteni-
do con una alícuota de las AuNPs sinte-
tizadas por reducción del ácido tetracloro
áurico con citrato.
La aparición de un máximo de absorción
a 525 nm, es característico de AuNPs con
un tamaño de 16 a 20 nm, de acuerdo a
los resultados reportados en la literatura
(11). La Figura 2B muestra la imagen
obtenida por TEM de las AuNPs sinteti-
zadas, observándose que presentan una
forma irregular y un tamaño promedio de
16,2 ± 1,1 nm.
Resultados y Discusión
Para la construcción del inmunosensor se modificó
electroquímica y químicamente una superficie electródica
de carbón vítreo con sustancias orgánicas (TIO y AM)
e inorgánicas (AuNPs), de tal forma de que sirvieran
de soporte para el anclaje del componente biológico (el
anticuerpo).
Primero la TIO fue electrodepositada sobre la superficie
de CV utilizando la técnica de VC, ciclando 10 veces entre
-0,8 y 1,5 V al electrodo de CV en una solución acuosa de
0,25M de TIO.
Kirchnerová y Purdy (1981) (9), confirmaron que en
soluciones ácidas y neutras, la oxidación de tiourea
procede por la vía de una reacción de transferencia
electrónica lenta de un electrón, reduciéndole a radical
[(NH ) -C-S-]+a 0,7 V. La siguiente oxidación de este
2 2
radical, se da solamente a potenciales más elevados (1,2
V). De hecho, durante la electrolisis de tiourea en medio
ácido, se forma un precipitado blanco, identificado como
C,C´ditioformamidiniodinitrato. La TIO fue adsorbida
sobre la superficie de carbón vítreo a través de sus grupos
funcionales aminos, durante la aplicación de diez barridos
de potencial entre -0,8 a 1,5 V a una velocidad de 0,1 V/S
por voltamperometría cíclica (10).
La Figura 3, muestra la familia de vol-
tamperogramas obtenidos con el sensor
SECV/TIO
modificado
con diferentes ca-
pas de AuNPs/AM en solución regulado-
ra de fosfato 0,1 M, pH 6,7. Las AuNPs
que están cargadas negativamente pueden
ser adsorbidas sobre la tiourea, el azul de
metileno que a un pH de 6,7 está cargado
positivamente es atraído fácilmente por
las AuNPs. Una vez formado la primera
capa de AM/AuNPs sobre el electrodo
modificado SECV/TIO, se puede seguir
adsorbiendo por atracción electrostática
otras capas de AM/AuNPs hasta desarro-
llar el sensor electroquímico SECV/TIO/
(AuNPs/AM)n/AuNPs.
La Figura 1 muestra los voltamperogramas obtenidos con
el electrodo
modificado
de CV con tiourea y sin modificar
en solución reguladora de fosfato 0,1 M, pH 6,7.
.
20
Figura 1. Voltamperogramas obtenidos en solución reguladora de fosfato 0,1 M
pH 6,5 con un el sensor sin modificación química (SECV) y con el modificado
con TIO (SECV/TIO)
Figura 2. A) Espectro UV/VIS de una mezcla coloideal
de oro en medio acuoso obtenido empleado un
espectrofotómetro UV/VIS JEWAY y una celda plástica
de 1cm de espesor. B) Imagen de AuNPs de oro
obtenidas por TEM de las síntesis con citrato de sodio.
ISSN 1390-5740 Número 15 Vol. 1 (2016)
ISSN 2477-9105
Menolasina, Rodríguez
concentraciones variables de antígenos no específicos
(testosterona), no muestra ningún cambio en su respuesta
electroquímica.
Figura 3. Familia de voltamperogramas obtenidos con
pH 6,7
A medida que se incrementa el número
de capas se observa un incremento de una
corriente de pico de oxidación. El azul
de metileno es un colorante catiónico
cargado positivamente con un proceso
redox reversible en soluciones acuosas,
cuyo potencial formal E0 varía entre
-0,10 y -0,40 (Vs ECS) en un rango de
pH de 4 a 11, lo que lo hace un mediador
Al evaluar dicho
inmunosensor, SECV/TIO/(AuNPs/
AM)5/AuNPs/Ac/Ad en presencia de diferentes cantida-
des de una suspensión preparada por trituración de las ho-
jas que recubren al bulbo de muestras de Allium sativum
provenientes del municipio Rivas Dávila (Bailadores) del
estado Mérida y mezclando en solución reguladora de fos-
fato 0,1 M pH 6,5 y posteriormente filtrada, se observa
que el mismo responde al variar la cantidad de suspensión
que se agrega a la celda electroquímica. A medida que se
adicionan cantidades
específicas
de la suspensión, la señal
del pico de oxidación disminuye de manera proporcional
al volumen añadido (Figura 5A y Figura 5B)
catalítico para
diferentes sistemas
biológicos (12). El AM en la multicapa
actúa como mediador de electrones.
La Figura 4 muestra la respuesta
electroquímica del sensor SECV/TIO/
(AuNPs/AM)5/AuNPs
al
ir
siendo
modificado con anticuerpos (Ac: anti-
Allexivirus específicos contra GarV-A)
y leche descremada y posteriormente
la
respuesta
electroquímica del
En la Figura 5B, se observa que la respuesta electroquímica
del inmunusensor decrece linealmente a medida de que se
realizan adiciones sucesivas de la suspensión preparada a
partir de las hojas que recubren al bulbo de muestras de
Allium sativum, en la celda electroquímica que contiene
solución reguladora de fosfato 0,1 M, pH 6,7. Este
comportamiento es indicativo que las muestras de ajos que
se procesaron están contaminadas con el virus GarV-A.
inmunosensor construido frente a la
presencia de diferentes cantidades del
antígeno testosterona. Se observa que
la respuesta electroquímica disminuye a
medida que se adsorben los anticuerpos
y la leche descremada (Ad) como
consecuencia del bloqueo de la superficie
electroquímica del sensor. Una vez que
la superficie electródica se modifica con
los anticuerpos y se bloquean los sitios
activos donde no se han adsorbidos estos
con Ad, se tiene el inmununosensor,
el cual al ser evaluado en presencia de
21
Figura 4. Respuesta electroquímica del sensor SECV/TIO/(AuNPs/AM)5/
AuNPs al ir siendo modificado con anticuerpos (Ac: anti-Allexivirus específicos
contra GarV-A), leche descremada (Ad) y su comportamiento frente a un
antígeno no específico
Figura 3. Familia de voltamperogramas obtenidos co
el sensor SECV/TIO modificado con diferentes capas
de AM/AuNPs en solución reguladora de fosfato 0,1 M,
La respuesta del inmunosensor presentó
una linealidad aceptable, demostrando
que el inmunosensor responde de manera
proporcional a la concentración de
Allexivirus en solución, además la prueba
de interferentes demostró que la respuesta
del inmunosensor es específica, ya que
no hubo respuesta ante la presencias de
bacterias interferentes.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Consejo de
Desarrollo Científico Humanístico
Tecnológico y de las Artes de la
Universidad de Los Andes (CDCHTA)-
ULA,
proyecto:
FA-517-12-08-A,
por la financiación de este trabajo y al
Instituto Nacional de Investigaciones
Agropecuarias del Estado Mérida-
Venezuela por
su
colaboración en
Conclusiones
El
inmunosensor
SECV/TIO/(AuNPs/AM)5/AuNPs/
el
suministro
de los
anticuerpos
Ac/Ad desarrollado permitió la detección de Allexivirus
en muestras de ajo Allium sativum provenientes del
municipio Rivas Dávila (Bailadores) del estado Mérida.
mononucleares
anti-Allexivirus
específicos
contra GarV-A.
R
eferencias
2.
3.
4.
Pardo A, Hernández A, Méndez N. Caracterización molecular de siete clones de ajo (Alliumsa-
Velásquez VR, y Reveles HM. 2012; Manejo de Enfermedades Virales de Ajo en Zacatecas.
Ryabov EV, Generozov EV, Vetten HJ , Zavriev SK. 1996; Analysis of the 3-region of the mite
103–110.
nome. J. Gen. Virol. 79: 155–159.
C, members of the new
lyratifiedgenus
Allexivirus. Arch Virol 144: 1819–1826.
step electrodeposition of chitosan-gold nanoparticles biocompatible film on Au microelectrode for
8.
Chai R, Yuan R, Chai Y, Ou Ch, Cao Sh, Li X. 2008. Amperometric immunosensors based on
bón electrode for determination of human chorionic. Talanta. 74(5): 1330-1336.
ca Chimica Acta, 123: 83-95.
puestos orgánicos y nanopartículas de oro como sensores de dopamina. Avances en Química. 8(3):
11. Cai H, Xu C, He P, Fang Y. Colloid Au-enhanced DNA immobilization for the electrochemical
12. Li M, Gao F, Yang P, Wang L, Fang Y. Conveniently assembling dithiocarbamate and gold
tion. Surf. Sci. 602: 151-155.
22
1. Pardo A, Marín C. 2003; Caracterización de cultivares de ajo en Cubiro, Estado Lara. Agrono-
mía Tropical. 53(4): 381-395.
tivum L.) mediante la técnica RAPD. Bioagro. 2(21): 81-86.
Folleto Técnico No. 40. Campo Experimental Zacatecas, CIRNOC - INIFAP, 26 p.
born filamentous virus genome testified sits relation to the shallot virus X group. Mol. Biol. 30:
5. Song SL, Kim JT, Lee CH, Choi JS. 1998. Molecular characterization of the garlic virus X ge-
6. Sumi S, Matsumi T, Tsuneyoshi T. 1999. Complete nucleotide sequences of garlic viruses A and
7. Ma H, Sun J, Zhang Y, Bian C, Xia S, Zhen T. 2016. Label-free immunosensor based on one-
determination of aflatoxin B1 in maize. Biosens & Bioelectr. 22-29.
layer-by-layer assembly of gold nanoparticles and methylene blue on thiourea modified glassy car-
9. Kirchnerová J, Purdy W. The mechanism of the electrochemical oxidation of thiourea. Analyti-
10. Menolasina S, De Oliveira MI , Travieso C.
Superficies
de carbón vítreo
modificadas
con com-
139-144
detection of sequence-specific DNA. J. Electroanal. Chem. 510: 78-85.
nanoparticles onto the gold electrode: A new type of electrochemical sensors for biomolecule detec-
Figura 5. A) Respuesta electroquímica del inmunosensor en presencia del virus
GarV-A presente en muestras de ajos provenientes del Municipio Bailadores,
Edo. Mérida. B) Comportamiento lineal de Ip vs. Número de adiciones de 10
mL de una suspensión de hojas del bulbo de ajos contaminados con el virus
GarV-A
ISSN 1390-5740 Número 15 Vol. 1 (2016)
ISSN 2477-9105