R
esumen
A
bstract
20
ISSN 2477-9105 Número 21 Vol. 1 (2019)
El objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad cicatrizante del extracto de Hierba mos-
quera (Croton elegans Kunth) en ratones (Mus musculus). Con el extracto etanólico concentrado
se realizó cuantificaciones espectrofotométricas para flavonoides totales expresados en porcentaje
de rutina y de compuestos fenólicos mediante el micrométodo de Folin-Ciocalteau, y determina-
ción colorimétrica de tanino expresado como ácido tánico. En la evaluación de actividad cicatri-
zante se utilizaron 18 ratones (Mus musculus) albinos con peso de 35 a 40g, dos meses de edad, 12
machos y 6 hembras provenientes del bioterio de la facultad de Ciencias (ESPOCH). Divididas en
6 grupos experimentales, 3 para cada tratamiento: extracto etanólico de hierba mosquera en con-
centraciones del 20%, 40% y 80%, el control negativo fueron ratones con heridas sin tratamiento, y
para controles positivos se aplicaron eterol y crema base de acetato de prednisolona con sulfato de
neomicina. Se midió la longitud de la herida y examen histopatológico del corte de piel del lugar
de lesión. El contenido total de flavonoides fue 80µg, contenido total de fenoles 2.07µg y la concen-
tración de compuestos tánicos 24,36µg. El test Tukey con nivel de significancia 0,05% reveló que el
extracto etanólico al 80% tuvo mayor efectividad. El extracto etanólico al 80% de hierba mosquera
expone reconstitución total de tejido en menor tiempo demostrando actividad cicatrizante.
Palabras Claves: Hierba Mosquera (Cronton elegans Kunth) ,ratones (Mus musculus), actividad
cicatrizante, extracto etanólico
The objective of the present study was to evaluate the cicatrizant activity of hierba mosquera
extract (Croton elegans Kunth) in mice (Mus musculus). With the concentrated ethanolic extract,
spectrophotometric quantifications performed for total flavonoids expressed as a percentage of
rutin and phenolic compounds by means of the Folin-Ciocalteau micromethod, and colorimetric
determination of tannin expressed as tannic acid. In the evaluation of healing activity, 18 albino
mice (Mus musculus) weighing 35 to 40g, two months old, 12 males and 6 females from the faculty of
sciences (ESPOCH). Divided into 6 experimental groups were used, 3 for each treatment: ethanolic
extract of hierba mosquera in concentrations of 20%, 40% and 80%, the negative control were mice
with wounds without treatment, and for positive controls, eterol and prednisolone acetate base
cream were applied with neomycin sulfate. The length of the wound and the histopathological
examination of the skin cut at the site of injury measured. The total content of flavonoids was 80g,
total phenol content 2.07g and the concentration of tannic compounds 24.36g. The Tukey test
with significance level 0.05% revealed that the 80% ethanolic extract was more effective. The 80%
Evaluación de la actividad cicatrizante de hierba mosquera (Cronton elegans
Kunth) en ratones (Mus musculus)
Evaluation of the cicatrising activity of hierba mosquera (Cronton elegans Kunth) in mice
(Mus musculus)
1
Cecilia Toaquiza Aguagallo*,
2
Cristina Tigse Moposita,
1
Elizabeth Escudero Vilema,
1
Aída
Miranda Barros,
3
Víctor Guangasig Toapanta
1
Grupo de Investigación de Tecnología y Atención Farmacéutica – Escuela Superior Politécnica
de Chimborazo, Riobamba, Ecuador
2
Hospital de Especialidades Eugenio Espejo. Ministerio de Salud Pública, Quito, Ecuador
*cecytoaquiza@gmail.com
3Universidad Técnica de Ambato, Ambato, Ecuador
21
Toaquiza, Tigse, Escudero, Miranda, Guangasig
I. INTRODUCCIÓN
La gran diversidad de la flora ecuatoriana
ha sido reconocida y estudiada desde hace
mucho tiempo, y desde siempre reconoci-
da por ser inmensamente rica en plantas
útiles (5172 especies) de las cuales el 60%
son medicinales. Según la enciclopedia de
plantas útiles del Ecuador en el país exis-
ten 144 familias (17%) que incluyen 825
especies de plantas que son utilizadas para
aliviar heridas y lesiones (1).
Las familias de mayor uso para aliviar he-
ridas y lesiones son Asteraceae, Solanaceae
y Euphorbiaceae, numerosas de las especies
incluidas favorecen la pronta cicatrización,
sobre todo de heridas causadas por objetos
corto-punzantes, entre ellas son muy cono-
cidos el matico (Aristeguietia glutinosa), en la
Sierra, y la sangre de drago (Croton lechleri),
en la Amazonía. La hierba mosquera (Cro-
ton elegans kunth) incluida también en esta
categoría no reporta estudios previa compro-
bación científica de esta actividad farmacoló-
gica (1).
Según el catálogo de Plantas Vasculares del
Ecuador Croton elegans Kunth es una espe-
cie endémica del Ecuador perteneciente a la
familia Euphorbiaceae (2). De acuerdo a la
literatura botánica, esta planta es un arbusto
de la vegetación seca interandina, que crece
entre 1500 y 3500 msnm (3). Presenta mu-
chas aplicaciones en la medicina tradicional
ecuatoriana, se utiliza como antiinflamato-
rio, en el tratamiento de dolor de muela, he-
ridas amigdalitis y verrugas. También se ha
utilizado en el tratamiento de reumatismo,
gota, neuralgia y bronquitis (4).
Se atribuye a compuestos fenólicos activida-
des antiinflamatorias y cicatrizantes; y se ha
identificado la presencia de los mismos en
hierba mosquera (4). El objetivo de la presente investigación fue
evaluar la actividad cicatrizante del extracto de Croton elegans
Kunth en ratones (Mus musculus).
II. MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
La identificación taxonómica de la hierba mosquera (Croton
elegans Kunth) se lo realizó en el Herbario de la Escuela Su-
perior Politécnica de Chimborazo (ESPOCH) y fue recolec-
tada en la parroquia Picaihua de la provincia de Tungurahua
a 2600 msnm y temperatura promedio de 15 °C.
Material de laboratorio
PREPARACIÓN DE LOS EXTRACTOS: Se pesaron para
cada extracto 30 g de material vegetal secado en estufa
(Memmert) con circulación forzada de aire a 40 °C ± 1 °C,
el material seco se pulverizó hasta un tamaño de partícula
máximo de 0.5 mm, y fueron macerados con éter, etanol (40
%) en zonicador (Branson 3510) durante 3 horas a tempera-
tura de 25 °C ± 1 °C, luego se filtró y conservó los extractos
para los análisis en frascos ámbar a 4 °C (5) (6).
ENSAYO FITOQUÍMICO: La identificación cualitativa de
metabolitos secundarios de los extractos se realizó según ta-
mizaje fitoquímico general (7).
CONTROL DE CALIDAD DEL EXTRACTO ETANÓLI
CO: Se identificaron las características organolépticas del
extracto, y se realizó el análisis microbiológico para lo se uti-
lizó placas petrifilm con 1 mL del extracto etanólico (20, 40
y 80 %), incubados a 30 ±1 °C durante 72 ± 2 horas.
ENSAYOS CROMATOGRÁFICOS PARA FLAVONOI
DES: Se realizó en placas de silica gel (2 cm x 10 cm), el sis-
tema de solventes utilizado fue cloroformo - acetona - acido
fórmico (7.5:1.7:0.8), y revelado con sulfato de cerio (8).
CONTENIDO DE FLAVONOIDES: Se realizó cuantifica-
ción espectrofotométrica de flavonoides totales expresado
ethanolic extract of hierba mosquera exposes total tissue reconstitution in less time, demonstrating
cicatrizant activity.
Keywords: Hierba Mosquera (Cronton elegans Kunth), mice (Mus musculus), healing activity,
ethanolic extract
Fecha de recepción: 03-10-2018 Fecha de aceptación: 31-01-2019
22
ISSN 2477-9105 Número 21 Vol. 1 (2019)
en porcentajes de rutina, según el método
de Shinet al con ligeras modificaciones.
Se tomó 250 µL de extracto con 400 µL
de agua destilada, se adicionó 38 µL de
AlCl
3
al 10 % p/v, se agitó y dejó a 25 °C
durante 6 min; se agregó 250 µL de NaOH
1M y completó el volumen final de 1250
µL con agua destilada. La absorbancia de
la reacción fue medida a 400nm en espec-
trofotómetro UV visible Hewlett Packard.
La concentración de flavonoides fue esta-
blecida empleando una curva de calibra-
ción con un estándar de rutina a diferentes
diluciones. Los resultados se expresaron
como µg de rutina/ g de muestra (9) (10).
CONTENIDO DE COMPUESTOS FE
NÓLICOS: Se realizó cuantificación es-
pectrofotométrica mediante el micromé-
todo de Folin- Ciocalteau. Una alícuota
10 µL de extracto se aforó a 100 mL. A 10
mL de la dilución se añadieron 1.5 µL del
reactivo de Folin-Ciocalteau (ácido fosfo-
túngtico con ácido fosfomolibdico) en la
oscuridad, se adicionó 2 µL de carbonato
de sodio al 20 %. Se midió la absorbancia
a 700 nm (11).
La concentración de compuestos fenólicos
totales se determinó empleando una curva
de calibración con ácido gálico como es-
tándar. Fue expresado en µg de ácido gáli-
co/mL de extracto (12) (13).
DETERMINACIÓN DE TANINOS: Se
realizó determinación colorimétrica de ta-
ninos expresados como ácido tánico por el
método de Folin- Ciocalteau. A 0.1µL de
extracto etanólico se aforó a 100 mL con
agua destilada. A 10 mL de la dilución se
añadió 2 µL de reactivo de Folin – Cio-
calteau, protegido de la luz para evitar la
oxidación. La concentración de taninos se
determinó utilizando ácido tánico a dife-
rentes diluciones. Los resultados se expre-
saron como µg de ácido tánico/gramo de
tejido vegetal (14).
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD CI
CATRIZANTE: Se utilizó 18 ratones albi-
nos (Mus musculus) distribuidos al azar en 6 grupos de 3
ratones, con un peso entre 35 y 40 g, de 2 meses de edad pro-
venientes del bioterio de la ESPOCH, a condiciones ambien-
tales: humedad relativa de 50 ± 10 % , temperatura de 22 ±
2 °C, con periodos de fotoluminiscencia de 12 horas de luz y
12 horas de oscuridad. Se alimentaron con dieta balanceada
y agua clorada. El período de ambientación fue durante 15
días. Se conservó normas asépticas durante el periodo del
ensayo (15) (16).
Terminado los días de aclimatación se procedió a depilar la
mitad del tercio superior del lomo (dorso del animal) de cada
ratón, a las 48 horas al no observarse irritación en la piel, se
procedió a realizar las heridas de 2 cm de longitud por 2 mm
de profundidad con la ayuda de un bisturí en condiciones
asépticas. Posteriormente se administraron los tratamientos
a los grupos experimentales de la siguiente manera (17) (18).
• CN (control negativo) ratón con herida sin trata-
miento.
• CL (control positivo) se aplicó con la ayuda de un
hisopo crema dérmica comercial a base de acetato de pred-
nisolona/sulfato de neomicina).
• CE (control positivo) se aplicó eterol (fenol 1g, viole-
ta de genciana 0.4g, excipiente alcohólico 100 mL) (19).
• EC1 se aplicó 3 gotas del extracto al 20%
• EC2 se aplicó 3 gotas del extracto al 40%
• EC3 se aplicó 3 gotas del extracto al 80%
Se midió la longitud de la herida por el lapso de 16 días cada
48 horas. Al término del ensayo se procedió a la eutanasia de
los animales de experimentación. Se realizó un corte de la
piel en el lugar de la herida y fueron conservados en formol
para su análisis histopatológico.
El análisis de datos se realizó por el programa IBM SPSS®
Statics versión 20.0 aplicando pruebas de estadística descrip-
tiva e inferencial paramétrica ANOVA de un factor y estu-
dios post hoc (test Tukey)
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el análisis cualitativo (Tabla 1) se observó en el extracto
etanólico la presencia de compuestos con actividad cicatri-
zante, flavonoides y fenoles. (20)
23
El extracto etanólico presentó característi-
cas organolépticas propias de Croton ele-
gans Kunth con un color combinado de
verde con café oscuro, de aspecto líquido,
olor herbal y sabor dulce por la presencia
de azucares.
Los resultados del análisis microbiológico
demostraron ausencia de coliformes tota-
les (10 UFC/mL), moho y levaduras (<10
UFC/mL) y aerobios mesófilos (103 UFC/
mL) del extracto madre y los extractos al
20 %, 40 % y 80 %, acorde a las especifi-
caciones de la USP 28, el extracto es apto
para uso experimental (21).
En el ensayo cromatógrafico según el mé-
todo de Wagner (1996) se evidenció la pre-
sencia de flavonoides como la quercetina
(Rf 0.3) y compuestos fenólicos como el
ácido isoclorogénico (Rf 0.7), metabolitos
relacionados con actividad antinflamato-
ria y cicatrizante (8)
El contenido total de flavonoides expresa-
do con respecto a la rutina fue en valor de
320 µg/g de muestra.
El contenido de compuestos fenólicos ex-
presados con respecto al ácido gálico fue
2.07 µg/mL de extracto, la concentración
de compuestos tánicos totales fue 24.36
µg/g de muestra, siendo estos los compues-
tos relacionados con actividad antinflama-
toria y cicatrizante (22).
Metabolitos secundarios Ensayo Extracto
etéreo
Extracto etanó-
lico
Extracto
acuoso
Aceites – grasas Sudan +
Lactonas – cumarinas Baljet + (↓)
Alcaloides Dragendorf +++ (↓) +
Alcaloides Mayer +
Alcaloides Wagner (↓) +
Flavonoides Shinoda + +
Azucares reductores (↓)
Grupo de avonoides anto-
cianos
Antocianos +
(↓) precipitación, (+) baja evidencia, (+++) alta evidencia
Tabla 1. Análisis Cualitativo del extracto alcohólico de Croton elegans kunth
Grupo Cicatrización (días) Longitud (cm)
CN 15 ± 0.8 1.16 ± 0.037
CL 13 ± 0.7 1.12 ± 0.035
CE 11 ± 0.7 1.13 ±0.022
EC1 14 ± 0.7 1.11 ± 0.048
EC2 10 ± 0.5 0.85 ± 0.010
EC3 8 ± 0.4 0.91 ± 0.045
Tabla 2. Efecto cicatrizante del extracto de Croton elegans kunth.
En el análisis del efecto cicatrizante del extracto de Croton
elegans Kunth evaluada mediante la media del tiempo en
días para la cicatrización (Tabla 2), el tratamiento EC3 pre-
sentó un efecto mayor frente a los otros tratamientos obte-
niendo un promedio de cicatrizacion de 8 días, se sugiere
que la mayor presencia de compuestos fenólicos en el extrac-
to al 80% consiguió acelerar el proceso. (4)
Origen de
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Promedio
de los cua-
drados
F
a
Probabili-
dad
Valor críti-
co para F
b
E n t r e
grupos
96.94 5 19.39 14.54 0.00 3.11
Dentro de
los gru-
pos
16 12 1.33
Total 112.94 17
a. Fisher tabulado (Ftab)
b. Fisher calculado (Fcal)
Tabla 3. ANOVA de un factor para los días de cicatrización
Toaquiza, Tigse, Escudero, Miranda, Guangasig
24
ISSN 2477-9105 Número 21 Vol. 1 (2019)
De acuerdo a los datos de ANOVA (Tabla 3) se pudo obser-
var que existe variación entre grupos de acuerdo al valor de
Fcal (3.11) en comparacion en Ftab (14.54) lo que indica que
el efecto del extractro alcohólico de Croton elegans Kunth
en las heridas presenta una variacion significativa al p= 0.05
frente a los entes de control.
Dias de cicatrización
HSD Tukey
a
Subconjunto para alfa = 5
Tratamiento N
1 2 3
EC3 3 8.67
EC2 3 10.00
CE 3 11.00 11.00
CL 3 13.3 13.3
EC1 3 14.3
Cont. Neg. 3 15.00
Sig. 2.06 2.06 .518
Se vizualiza las medias para los grupos en los subconjuntos homo-
geneos
a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 3,00
Tabla 4. Test de Tukey respecto a los días de cicatrización
Según la prueba de subconjuntos de grupos de Tukey (Tabla
4) con un nivel de significancia 0.05, se observaron tres sub-
grupos, de los cuales el tratamiento EC3 (extracto al 80%)
presentó mayor efectividad con 8.67 días en promedio.
En el analisis histopatologico macroscopico de los cortes de
las pieles de los animales de experimentación los cinco gru-
pos presentaron coloración blanca y aspecto liso. El grupo
EC3 correspondiente al extracto al 80% la piel esta cubierta
de pelaje y no se observa huella de la herida.
Grupo expe-
rimental
MNN
Histocitos
Edema
Fibras de
colágeno
Tejido co-
nectivo
Tejido cica-
tricial
EC3 + - ++ ++ 100 90
EC2 + - - ++ 80 90
EC1 + - - ++ 50 80
CE + - + ++ 80 100
CL + - - ++ 100 80
CN + - ++ - 60 100
Tabla 5. Analisis microscopico histopatologico de pieles de ratones
Mediante el análisis microscópico (Tabla
5) de las placas elaborados en base a la piel
se observó los tejidos reconstituidos inte-
riormente, siendo favorable el extracto al
80%, pudiendo atribuirse químicamente
la actividad cicatrizante a la presencia de
compuestos fenólicos de tipo flavonoide
porque estos metabolitos intervienen en la
cicatrización al evitar la liberación de pros-
taglandinas e histaminas, evitan la migra-
ción de elementos formes (neutrófilos y
otros). Además, estabilizan la membrana
celular capturando a los radicales libres
presentes, evitando así el daño celular y
activando el complejo sistema bioquímico
para la regeneración del tejido. (20) (23)
IV. CONCLUSIONES
Mediante el tamizaje fitoquímico se deter-
minó la presencia de metabolitos secun-
darios de interés farmacológico, siendo
los flavonoides identificados en el extracto
etanólico importantes para la presente in-
vestigación.
El ensayo cromatográfico evidenció la pre-
sencia de flavonoides y compuestos fenóli-
cos en el extracto etanólicoe.
El contenido total de flavonoides (320µg/g
de muestra), compuestos fenólicos (2.07µg/
mL de extracto) y compuestos tánicos to-
tales (24.36µg/g de muestra), lo cual es un
indicio de potencial farmacológico rela-
cionados con actividad antinflamatoria y
cicatrizante de Croton elegans Kunth.
Mediante el estudio de restauración de
heridas provocadas a ratones (Mus mus-
culus), el extracto etanólico de al 80% de
hierba mosquera presentó una diferencia
significativa al ser comparados con la cre-
ma base de acetato de prednisolona/sulfato
de neomicina, el eterol, y el control, corro-
borándose con el respectivo estudio histo-
lógico, en el que se presentó una reconsti-
tución del tejido más rápida. Se evidenció
con bases científicas la actividad cicatri-
zante de Croton elegans Kunth.
R
eferencias
25
1. L. de la Torre, H. Navarrete, P. Muriel M., M. J. Macía & H. Balslev (eds.). Enciclopedia de Plantas útiles
del Ecuador Quito & Aarhus: Herbario QCA & Herbario AAU; 2008.
2. P.M. Jørgensen SLY. Catalogue of the Vascular Plants of Ecuador St. Louis,: Missouri Botanical Garden
Press; 1999.
3. León-Yánez S, Valencia R, Pitman N, Endara L, Ulloa C. Libro rojo de las plantas endémicas del Ecuador.
2nd ed. Quito: Publicaciones del Herbario QCA, Pontificia Universidad Católica; 2012.
4. Herrera C, Pérez Y, Morocho V, Armijos C, Malagón O, Brito B, et al. PRELIMINARY PHYTOCHEMI-
CAL STUDY OF THE ECUADORIAN PLANT. J. Chil. Chem. Soc. 2018; 63(Nº 1).
5. Dominguez X. Métodos de Investigación Fitoquimica. 1st ed. México: Limusa ; 1973.
6. Muñoz J. Guia para el analisis de vegetales Universidad Central del Ecuador , editor. Quito: Universitaria;
1982.
7. Luck O. Investigación Fitoquímica: Métodos de estudios de productos naturales. 3rd ed. Lima: Fondo
Editorial Pontifice Universidad Catlica del Perú ; 2016.
8. Bladt S. Plant Drug Analysis. A Thin Layer Chromatography Atlas. 2nd ed. Berli-Alemania: Springer;
1996.
9. Játiva C. Texto básico de farmacognosia de los vegetales a las medicinas Riobamba: Editorial ESPOCH;
2010.
10. Makka H, Bluemel M, Borowy N, Becker K. Gravimetric determination of tannins and their correla-
tions with chemical and protein precipitation methods. J. Sci. Food Agrio. 1993;(61): p. 161-165.
11. García E, Fernández I, Fuentes A. Determinación de polifenoles totales por el método de Folin Ciocal-
teu. Universitat Politècnica de València. Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica y del Medio
Natural. 2015 Jun.
12. Ricco R, Wagner M, Portmann E, Reides C, Gurdi A, Carballo M. Analisis de polifenoles, actividad
antioxidante y genotoxicidad en especie argentinas de Lippia y Aloysia (Verbenaceae). Boletín Latinoame-
ricano y del Caribe de Plantas Medicinales y aromáticas. 2010; 9(5): p. 388-396.
13. Maksimovic Z, Malencic D, Covacevic N. Polyphenol contents and antioxidant activity of Mayadics
stigma extracts. Biores. Tech. 2005; 96: p. 873 - 877.
14. Kasay MI, Humán J, Guerrero M. Estudio cualitativo y cuantitativo de taninos de la OENOTHERA
ROSEAL L'HÉR. EX AITON. Rev.Per.Quím.Ing.Quím. 2013; 16(1): p. 13-19.
15. Mancebo B, Sánchez L, Díaz S, Gouchea C, Regalado A, Escobar A, et al. Efecto cocatrizante de la pasta
de clorofila-caroteno de Pinus caribaea var. sobre heridas abiertas asépticas. Revista Cubana de Plantas
Medicinales. 2011; 16(1): p. 24-33.
16. Victoria M, Morón F. Bioetica en experimentación animal para validar usos de planas medicinales en
el Laboratorio Central de Farmacología. Revista Cubana de Plantas Medicinales. 2010; 15(3): p. 157-158.
17. Gónzalez r. Modelos experimentales para la evaluación de la acción cicatrizante de medicamentos. Rev
Cubana Farm. 2002; 36(189-196).
18. Gallardo J, Barboza L. Efecto cicatrizante del gel elaborado del látex de Croton lechleri "Sangre de Dra-
go". Revista Cientifica Ciencias Médicas. 2015; 18(1): p. 10 - 16.
19. Manualzz. Veterinario 2015. [Online].; 2015 [cited 2015 06 15. Available from: https://manualzz.com/
doc/5605682/veterinario-2015.
20. Soriano M, Bonilla P, Arroyo Acevedo J, Pereyra S. Actividad cicatrizante tópica de los metabolitos
secundarios en el extracto etanólico de hojas de Senecio culcitoides Weed. Folia dermatol. 2004 dic; 15(3):
p. 155-159.
21. Rockville. US. United States Pharmacopeial Convention, Inc. USP 28. The united states pharmacopeia.
NF 23. The national formulary ; 2005.
22. Sanchez J. Efecto de la quercetina y la rutina frente a daño oxidativo inducido en eritrocitos con distin-
tos contenidos de colesterol. Universidad de Salamanca. Departamento de Bioquímica y Biología Molecu-
lar ed. Salamanca: Tesis Doctoral; 2009.
23. Valencia C. Cicatrización: Proceso de reparación tisular. Aproximaciones terapeúticas. Folia dermatol.
2004; 15(3): p. 155-159.
Toaquiza, Tigse, Escudero, Miranda, Guangasig