ISSN 2477-9105 Número 22 Vol. 2 (2019)

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES: CARACTERIZACIÓN

DE COMPUESTOS BIOACTIVOS EN CINCO FRUTOS NATIVOS DE CHILE.

1,2

ME. Romero Román*,

F. Noriega Vásquez,

M. Farías Villagra,

P. Jara Zapata,

B. Vera Flores,

MD. López Belchi

*mariaeugeromero@udec.cl

esumen

Palabras clave: berries, polifenoles, antocianinas, capacidad antioxidante, HPLC-DAD.

bstract

Berries from central and southern Chile were analyzed in order to find promising sources of

polyphenols with clear activity on human health. Five native fruits like arrayan, white strawberry,

murtilla and calafate, and a traditional berry (grape called “tintorera”) were studied. Antioxidant

properties were determined in vitro according to the total polyphenol assay of Folin Ciocalteu, an-

thocyanins by differential pH, antioxidant capacity by measuring the capacity of reduction of the

free radical 2.2-diphenyl-1-picrylhydracil (DPPH) and iron reducing capacity (FRAP) and chemi-

cal profile by HPLC-DAD. Calafate showed the highest value (1066.4 ± 24.9 mg gallic acid / 100g

sample) for total polyphenols and anthocyanins (1031.9 ± 48.1 mg of cyanidin-3-glucoside / 100g

of sample) followed by blue grape. Calafate displayed excellent reducing power (11279.2 ± 2027.4

μmol Trolox / 100g FRAP assay and 5235.0 ± 445.9, μmol / 100g in DPPH), followed by grape. The

chemical profile of anthocyanins showed delphinidin, cyanidin, malvidin, petunidin, peonidin

and pelargonidin in the five berries. Around 30 flavonols derived from quercetin, myricetin and

isorhamnetin were identified as well as ellagitannins present in white strawberry, very interesting

compounds for further studies. These results contribute to highlight the potential use of these be-

rries as functional foods.

Key words: berries, polyphenols, anthocyanins, antioxidant capacity, HPLC-DAD.

New source of natural antioxidants: Characterisation of bioactive compounds in ve

native Chilean fruits

Fecha de recepción: 29-08-2018 Fecha de aceptación: 17-06-2019

Universidad de Concepción, Facultad de Agronomía, Departamento de Producción Vegetal, Labo-

ratorio de Análisis Químico, Concepción, Chile

Universidad Técnica de Babahoyo, Facultad de Agronomía, Departamento de Biotecnología,

Babahoyo, Ecuador

Diferentes berries de la zona centro y sur de Chile fueron analizados con el fin de buscar fuentes

promisorias de polifenoles con clara actividad sobre la salud humana. Se estudiaron cinco bayas nativas:

arrayan, frutilla blanca, murtilla y calafate, y un berry tradicional (uva tintorera). Se determinó in vitro sus

propiedades antioxidantes según el ensayo de polifenoles totales de Folin Ciocalteu, antocianinas por pH

diferencial, capacidad antioxidante por medición de capacidad de reducción del radical libre 2.2-difenil-1-

picrilhidracilo (DPPH) y poder de reducción férrica (FRAP) y perfil químico por HPLC-DAD. De los cinco

berries, calafate registró el valor más alto (1066,4 ± 24,9 mg GAE/100g de muestra) para polifenoles totales

y antocianinas (1031,9 ± 48,1 mg de cianidina-3-glucósido/100g de muestra) seguido por uva tintorera.

Calafate presentó excelente poder reductor (11279,2 ± 2027,4 μmol Trolox/100g ensayo FRAP y 5235,0 ±

445,9, μmol/100g en DPPH). El perfil químico de antocianinas mostró delfinidina, cianidina, malvidina,

petunidina, peonidina y pelargonidina en los cinco berries. Alrededor de 30 flavonoles derivados de

quercetina, myricetina e isorhamnetina fueron identificados así cómo elagitaninos presentes en frutilla

blanca, compuestos muy interesantes para estudios posteriores. Estos resultados contribuyen a destacar el

uso potencial de estos berries como alimentos funcionales.

I. INTRODUCCIÓN

La relación entre salud y nutrición ha

puesto su atención en compuestos bioac-

tivos de los alimentos que puedan mejo-

rar las condiciones y calidad de vida (1).

La principal fuente de nutrientes son las

frutas, las cuales aportan vitaminas, mi-

nerales, proteína y fibra. Por otro lado,

gracias al metabolismo secundario, las

plantas producen compuestos como ca-

rotenoides, esteroles, glucosinolatos, po-

lifenoles, entre otros; (2,3) que le sirven

para protegerse frente a factores bióticos

y abióticos (4) y para la comunicación

alelopática (5). Las bayas o “berries” son

frutas caracterizadas por ser aromáticas

y poseer vistosos colores. Estas carac-

terísticas son otorgadas por algunos de

los metabolitos secundarios antes men-

cionados, producidos por estas frutas

como mecanismo de protección frente

a radiación y baja temperatura (5,6). En

diversos estudios se ha determinado que

dichos compuestos brindan beneficios

claros en nuestra salud, ya que tienen la

capacidad de evitar el estrés oxidativo

(7).

Si se considera el contenido de compues-

tos bioactivos, a la presente fecha, la pro-

moción del consumo de frutos rojos es

creciente, ya que los compuestos quími-

cos que ellas producen, están asociados

con la protección frente a enfermedades

degenerativas (8), crónicas (9), inflama-

torias (10), entre otras. En Chile, existe

una amplia diversidad de bayas que cre-

cen bajo distintas condiciones ecológi-

cas (11), sin embargo, algunas como el

arrayán o arrayana (Luma apiculata)

(12), calafate (Berberis microphylla) (13),

frutilla blanca (Fragaria chiloensis ssp.

chiloensis) (14) y murtilla (Ugni molinae)

(15) que, por su condición silvestre o

de semi-domesticación, su valor a nivel

agronómico, industrial, y nutracéutico

aún no ha sido explotado. A pesar de no

ser nativa, otra baya de importancia por

su representatividad en la cultura vitivi-

nícola chilena es la uva tintorera, que es uno de los pocos

cultivares de Vitis vinifera con una pulpa de bayas de co-

lor rojo, (cultivar teinturier) y que por su alto potencial

de intensidad de color se usa para mejorar vinos menos

coloreados (16).

En la mayoría de los berries comerciales se han encontra-

do antocianinas como delfinidina glicosilada, petunidi-

na, malvidina, peonidina y cianidina (17–19) , así como

ácido elágico, y elagitaninos en frutillas y fresas (20); mu-

chos de ellos están asociados con los efectos de los bene-

ficios de salud (9). La absorción de fuentes de polifenoles

asegura la eliminación de radicales libres y también au-

menta las propiedades cognitivas y previene o reduce el

riesgo de enfermedades neurodegenerativas (21)

Por los antecedentes se conoce que las bayas tienen una

producción considerable de metabolitos secundarios la

misma que está condicionada por los factores edafoclimá-

ticos que rodeen a la planta, así, el presente trabajo busca

destacar el potencial de cinco berries nativos chilenos del

centro y sur de Chile, para promoción de futuros trabajos

y generación de alimentos funcionales en relación a los

compuestos bioactivos de arrayan, calafate, murtilla, fru-

tilla blanca y uva tintorera.

II. MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Se trabajó con bayas en estado óptimo de maduración co-

Figura 1. Berries en estudio y distribución en la zona centro y sur de Chile. A Uva tin-

torera (V. vinífera) B. Calafate (B. microphylla C. Arrayán (L. apiculata) D. Murtilla (U.

molinae) E). Frutilla blanca (F. chiloensis ssp. chiloensis).

Romero, Noriega, Farías, Jara, Vera, López

ISSN 2477-9105 Número 22 Vol. 2 (2019)

lectadas de la zona centro y sur de Chile: arrayana (Luma

apiculata) de Mulchén, Región de Bio-Bio, calafate (Ber-

beris microphylla) de Coyhaique, Región Aysén; frutilla

blanca (Fragaria chiloensis ssp.chiloensis) de Purén, Re-

gión de la Araucanía, murtilla (Ugni molinae) de Temu-

co, Región de la Araucanía y tintorera (Vitis vinífera) de

Quillón, Región de Ñuble (Fig. 1); y se mantuvieron a

-80°C en el Laboratorio de Química, Departamento de

Producción Vegetal de la Universidad de Concepción –

campus Chillan previo a su análisis.

Reactivos

Estándares comerciales de delfinidina-3-glucósido (98.84

%), cianidina3-glucósido (99.21 %), petunidin-3-glucó-

sido (99.90 %), malvidin-3-glucósido (99.91 %), Peoni-

din-3-glucósido (> 97 %), cianidina-3-lathyroside (> 97

%) de Sigma -Aldrich. El reactivo Folin-Ciocalteu, car-

bonato sódico (Na2CO3), buffer de cloruro de potasio

pH 1 y buffer acetato de sodio pH 4,5, el radical 2,2-di-

fenil-1-picrilhidracil (DPPH), Trolox, FeCl3-6H2O, HCl,

TPTZ por Merck (Alemania) y ácido fórmico, acetonitri-

lo, metanol y agua en grado HPLC de Merk.

Características físico-químicas y preparación de ex-

tractos

La determinación de las propiedades físico-químicas se

realizó a partir de frutos elegidos al azar. Se midieron

diámetros ecuatorial y polar de 20 berries por especie y

el peso en 100 frutos de cada una de las muestras. El pH,

solidos solubles y acidez se obtuvieron a partir de frutos

triturados, utilizando el pHmetro digital marca INOLAB

serie PH7110 para pH y la medición de solidos solubles

en °Brix utilizando un refractómetro SPER SCIENTIFIC

serie 300010. La acidez se determinó por titulación con

NaOH 0,1M a partir de 0,5 g de muestra triturada y di-

luida en 150 ml de agua destilada. La extracción de an-

tioxidantes se realizó por ultrasonido a partir de 0,5 g de

muestra en 5 ml de metanol/agua/acido fórmico (25:24:1

/ v: v: v) con 1 hora de ultrasonido, incubación a 0°C du-

rante 24h y posterior centrifugación a 3.500 rpm durante

15 minutos.

Determinación de polifenoles totales, antocianinas y

capacidad antioxidante

El análisis de polifenoles totales se realizó por el método

de Folin Ciocalteu (22), con una curva de calibración de

ácido gálico como estándar (0, 0.1, 0,25; 0,5 y 1 g/l) y

medición de la absorbancia de las muestras a una longi-

tud de onda de 760 nm a través de un espectrofotómetro

UV/vis Thermo Scientific; agregando a cada vial 120 μl

de reactivo de Folin Ciocalteu 1N, 25 μl

del extracto (muestra), 1,62 ml de agua

y finalmente 340 μl de la disolución de

carbonato de sodio al 20 %, y 2 horas de

incubación en oscuridad. El contenido

de polifenoles fue expresado en mg. de

equivalente ác. gálico /100g peso fresco

de muestra.

Para la determinación de antocianinas

totales se utilizó el ensayo de pH diferen-

cial con tampones de cloruro de potasio

0,025 M a pH 1 y acetato de sodio 0,4 M

a pH 4,5. (23) De cada extracto obtenido

previamente se extrajeron dos muestras

con 0,1 ml en dos tubos por separado se

agregó 2,9 ml de tampón KCl y al tubo 2

se adicionó 2,9 ml de tampón CH3CO-

2Na y se leyó la absorbancia a 510 y 700

nm de cada uno de los tubos (4 medidas

espectrofotométricas en total) en un es-

pectrofotómetro UV vis Thermo Scien-

tific™. Los datos se expresaron en mg de

cianidina-3-glucósido/100g de peso fres-

co.

El valor de capacidad antioxidante FRAP

se obtuvo con 30 µl del extracto, 300 µl

de agua destilada y la adición de 3000 µl

del reactivo FRAP (FeCl3-6H2O 20mM,

TPTZ10mM y tampón acetato 0,3mM)

incubados a 37 °C durante 30 min y me-

didos a 595 nm de absorbancia en el es-

pectrofotómetro antes descrito. El blan-

co fue agua destilada. Los resultados se

enunciaron como µmol trolox/100g de

muestra peso fresco. Respecto a la capa-

cidad antioxidante DPPH, se utilizó 100

µl del extracto y 2,9 ml de la solución

DPPH agitados constantemente y pos-

terior incubación en oscuridad durante

1 hora. Finalmente se realizó la lectura

a 515 nm. Los resultados se expresaron

en µmol trolox en100g de muestra peso

fresco. El blanco contenía 3 ml de me-

tanol.

Identificación y cuantificación de com-

puestos fenólicos por HPLC-DAD.

Los análisis HPLC-DAD para la identifi-

cación y cuantificación de polifenoles se

llevaron a cabo en una columna colum-

na Kromolith de fase inversa (RP) -18

(250-4,6 mm id) equipada con un detec-

tor de fotodiodos (DAD) (Merk-Hitachi,

Darmstadt, Alemania). con fase móvil

compuesto por dos disolventes: agua (A)

y ácido fórmico (B) (99:1, v/v) y caudal

de 1 ml/mincon variación del gradiente

de 8 % de disolvente B, 15 % a 25 min,

22 % a 55 min y 40 % a 60 min, man-

tenido hasta 70 min. Los compuestos se

identificaron por comparación con pa-

trones. Para los análisis cuantitativos,

se registraron los cromatogramas a 360

y 520 nm (Figura 2 y 3). Como están-

dares se utilizaron para las antocianinas

cianidina-3-glucósido a 520 nm y para

los flavonoles, quercetina-3-rutinósido a

360nm (Sigma Chemical Co. St. Louis,

MO).

Para determinar, polifenoles totales, an-

tocianinas totales y capacidad antioxi-

dante por los métodos FRAP y DPPH,

cada muestra se replicó tres veces y los

resultados se informan en medias ± des-

viación estándar y análisis de varianza

(ANOVA) con un nivel de significancia

p<0,05 y prueba de comparación de Tukey, utilizando el

programa estadístico SAS versión 8.0 para Windows.

III. RESULTADOS

Las características físico-químicas y preparación de ex-

tractos se presentan en la Tabla 1. Los resultados mues-

tran que el pH de los berries está entre 3,7 y 4,2. siendo

murtilla la más ácida y arrayan la más alcalina. Respecto

a los azucares totales, la frutilla posee 7,5 g/100g por ende

es la más dulce, seguido por calafate y uva tintorera. Es-

tas características confirman la posibilidad de aceptación

de estos berries para el consumo y aseguran el aprove-

chamiento de éstas en dietas sanas y/o la elaboración de

alimentos funcionales.

En la Tabla 2, se registra el valor más alto (1066,4 ± 24,9

mg ácido gálico /100g de muestra y 1031,9 ± 48,1 mg de

cianidina/100g de peso fresco) en polifenoles y antociani-

nas (respectivamente) en calafate superior a otros reportes

(24). Los valores menores en cuanto a polifenoles, se ob-

tuvieron para murtilla y frutilla blanca. Murtilla, presen-

tan un total de 260,5 ± 20,2 mg ác. gálico/100g muestra,

similar a otro reporte (15), mientras que, frutilla blanca

coincide con lo obtenido por otros investigadores (12).

Tabla 1 Comparación de características físico-químicas

de arrayan (L. apiculata), uva tintorera (V. vinífera), fruti-

lla blanca (F. chiloensis ssp. chiloensis), murtilla (U. moli-

nae) y calafate (B. microphylla) del centro y sur de Chile.

Fruto Peso (mg.) Diámetro

Ecuatorial (mm.)

Diámetro

Polar (mm.)

pH °Brix Azucares Totales

(g azúcar/100g)

Calafate 11,4 ± 0,6 c 10,00 ± 0,67 cd 7,81 ± 2,48 c 3,69 ± 0,06 c 27,1 ± 1,7 a 13,89 ± 0,45 b

Murtilla 12,5 ± 0,6 bc 9,93 ± 0,61 d 8,87 ± 0,47 c 3,67 ± 0,04 c 13,1 ± 0,6 c 8,24 ± 0,57 c

Uva 14,0 ± 0,6 bc 12,53 ± 1,09 b 14,02 ± 0,95 b 4,09 ± 0,05 ab 23,6 ± 1,0 b 14,45 ± 2,01 b

Arrayan 20,0 ± 0,4 b 12,12 ± 1,68 bc 12,12 ± 1,51 b 4,21 ± 0,08 a 9,6 ± 0,4 d 5,23 ± 0,46 c

Frutilla blanca 96,9 ± 6,6 a 32,43 ± 3,17 a 29,5 ± 3,26 a 3,97 ± 0,06 b 11,6 ± 0,4 cd 40,74 ± 2,12 a

Tabla 1. *Peso medido en mg. y los diámetros polar y ecuatorial en mm. Letras diferentes indican diferencias signicativas entre valores de la misma co-

lumna (p> 0.05).

En cuanto a capacidad antioxidante,

los resultados (Tabla 2) demuestran que

calafate posee el más alto poder reduc-

tor de radicales libre mediante método

FRAP (11279,2 ± 2027,4 μmol/100g); si-

milares datos han sido alcanzados pre-

viamente (13).

Para el radical DPPH, los mejores re-

sultados son calafate (5235,0 ± 445,9 a

μmol/100g.), arrayan (4401,7 ± 493,9)

y uva tintorera (4335,0 ± 156,1 μmol/100g). Los valores

para tintorera son superiores a lo reportado para uvas co-

merciales (27).

Tabla 2. Polifenoles totales, antocianinas totales, y capa-

cidad antioxidante por medición del poder de reducción

del radical libre DPPH y reducción férrica (FRAP) en ar-

rayan (L. apiculata), uva tintorera (V. vinífera), frutilla

blanca (F. chiloensis ssp. chiloensis), murtilla (U. moli-

nae) y calafate (B. microphylla) del centro y sur de Chile.

Romero, Noriega, Farías, Jara, Vera, López

ISSN 2477-9105 Número 22 Vol. 2 (2019)

Tabla 2. *Letras diferentes indican diferencias signicativas entre valores de la misma columna (p> 0.05).

Tabla 1. *Peso medido en mg. y los diámetros polar y ecuatorial en mm. Letras diferentes indican diferencias signicativas entre valores de la misma co-

lumna (p> 0.05).

Fruto

Polifenoles Totales

mg ác. gálico/100g

muestra

Antocianinas Totales

mg de cianidina/100g peso

fresco

DPPH

μmolTrolox /100g peso

fresco

FRAP

μmolTrolox/100g peso

fresco

Calafate 1066,4 ± 24,9 a 1031,9 ± 48,1 a 5235,0 ± 445,9 a 11279,2 ± 2027,4 a

Murtilla 260,5 ± 20,2 c 8,8 ± 1,2 d 2005,8 ± 848,6 b 5445,8 ± 316,6 a

Uva tintorera 639,5 ± 41,8 b 438,2 ± 12,0 b 4335,0 ± 156,1 a 3262,5 ± 288,3 bc

Arrayan 464,4 ± 31,6 c 287,7 ± 11,4 c 4401,7 ± 493,9 a 2104,2 ± 344,9 c

Frutilla blan-

273,4 ± 18,4 c 3,8 ± 0,4 d 2800,8 ± 175,3 b 1343,0 ± 250,0 c

El perfil químico (Fig. 2), a longitud de onda 360nm

muestra diferencias en los cromatogramas generando

más de 30 posibles flavonoles. Se reportaron 26 flavono-

les principalmente quercetina y myricetina para berries

similares a los utilizados en este estudio (26). La Fig. 2-C

muestra el cromatograma de frutilla blanca donde se han

marcado compuestos que esta fruta posee pero que no se

identificaron. Estos pudieran corresponder a elagitaninos

(ácido elágico, glucósidos de ác. elágico y elagitaninos),

además de pelargonidin-3-glucósido y

cianidina-3-glucósido como describen

otros investigadores (20) y similar a otro

reporte donde a partir de fruta liofili-

zada se encontraron 2,12 mg de quer-

cetina/g. (27) como parte de los ácidos

hidroxicinámicos (elagitaninos) y que

presentan evitan daños cardiovasculares

y cáncer (28).

Figura 3. Cromatogramas HPLC-DAD, longitud de onda 520 nm. A Arrayan (L. apiculata) B. Tintorera (V. vinífera) C. Frutilla blanca (F. chiloensis

ssp. chiloensis) D. murtilla (U. molinae) y E. calafate (B. microphylla).

En el presente estudio para los 5 berries

mediante HPLC-DAD se identificaron 9

antocianinas a partir de extractos, todas

ellas variantes glucosiladas de cianidi-

na, delfinidina, malvidina, peonidina,

petunidina y pelargonidina. Los cro-

matogramas individuales constan en la

Figura 3. Estos resultados son similares

a los reportados en otras investigaciones

donde se menciona que los compuestos

predominantes en todos los berries co-

mestibles son malvidina-3-glucósido,

cumarato de malvidina-3-glucósido y

la delfinidina-3-glucósido (24) (17) y se

destaca este último presente en calafa-

te (Fig. 3-E) que se encuentra en mayor

cantidad respecto a las otras bayas (27).

IV. DISCUSIÓN

Según la FAO, en frutas el pH 3,5 es el

mínimo requerido para la aceptación y

consumo (29); en consecuencia, todas

Romero, Noriega, Farías, Jara, Vera, López

las frutas analizadas en este trabajo pueden tener alta

probabilidad de ser aceptadas por los consumidores. Los

grados Brix (entre 5 y 20) y alto contenido de azúcares to-

tales son indicadores de madurez y calidad gustativa (30)

en este calafate y uva tintorera sobresalen. Por otro lado,

algunas antocianinas se enlazan con diferentes azúcares

(2), lo que indica que la presencia de altos contenidos de

azúcar podría potenciar el efecto de dichos flavonoides

frente al estrés oxidativo.

La caracterización de diferentes tipos de frutas y su con-

tenido de componentes antioxidantes específicos respon-

de a la orientación actual de consumo de alimentos que

contengan compuestos bioactivos y presenten beneficios

a la salud (3). Los resultados respecto a polifenoles y anto-

cianinas en calafate mostraron valores superiores a otros

reportes (24). Así mismo, se pudo constatar que todos los

berries en estudio poseen contenidos de compuestos fe-

nólicos considerables, incluso superiores a los resultados

reportados para bayas comerciales como en el caso de uva

tintorera (639,5 ± 41,8) frente a lo probado para uvas co-

merciales 460,45 ± 45 mg ácido gálico /100g de muestra

(17).

eferencias

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Así, el poder reductor de estas bayas es promisorio. Las

diferencias en las cuantificaciones analíticas, respecto

al poder reductor de las frutas nativas chilenas compa-

rado con los valores obtenidos por otros investigadores

se debe a que la cantidad de polifenoles totales como de

antocianinas totales depende de diversos factores medio

ambientales, localidad de recolección, etapa de madura-

ción, especie, tipo de cultivo, entre otros (31). De igual

forma, trabajos previos (9,10,32) demuestran que las an-

tocianinas tienen efectos beneficiosos para el tratamiento

de enfermedades crónicas, por ello, la referencia en tér-

mino de estos compuestos es importante para continuar

con estudios tanto in vitro como in vivo respecto a las

propiedades neuroprotectoras, cardioprotectoras, antiin-

flamatorias y anticancerígenas que estos berries pudieran

ofrecer.

V. CONCLUSIONES

Estos resultados preliminares indican que los perles

de antocianinas de las cinco 5 bayas recolectadas de la

región centro y sur de Chile mostraron un alto predo-

minio de antocianinas (delnidina y derivados de ciani-

dina). Calafate (B. microphylla) es la baya que mostró los

niveles más altos de antocianinas totales y actividad an-

tioxidante por el método FRAP y DPPH seguida de uva

tintorera y arrayan. Por su parte murti-

lla y frutilla blanca, a pesar de mostrar

cantidades menores de antocianinas y

polifenoles, gracias al estudio del per-

l químico, se encontraron compuestos

que podrían ser de interés para estu-

dios posteriores como los elagitaninos

en frutilla blanca (F. chiloensis ssp. chi-

loensis). Estos frutos ricos en compues-

tos polifenólicos tienen un futuro pro-

metedor para ser incorporados como

ingredientes funcionales, por lo que es

meritorio continuar con el estudio de

estas bayas.

VI. AGRADECIMIENTOS

Reconocimiento y gratitud al Labora-

torio de Análisis Químico del Depar-

tamento de Producción Vegetal de la

Universidad de Concepción, campus

Chillán, a CONICYT FONDECYT

1160899 de Chile y, al Instituto de Fo-

mento al Talento Humano y Secretaria

de Educación Superior de Ciencia, Tec-

nología e Innovación de Ecuador.

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